همسانه سازی و معرفی سازه خاموشی ژن codein-o-demethylase با استفاده از فن rnai در گیاه دارویی شقایق (papaver somniferum l)

شقایق(papaveer somniferum l.) به عنوان مهمترین منبع اقتصادی تولید ترکیبات آلکالوئیدی مورفینان مانند مورفین، کدوئین، تبائین، نارکوتین و پاپاورین شناخته شده است و از ترکیبات آن در صنعت داروسازی به عنوان بی حس کننده، ضد سرفه و ضد اسپاسم استفاده می شود. امروزه از فن مهندسی متابولیک، برای دستورزی ژن های بیوسنتز آلکالوئیدها و فرآورده های متابولیکی این گیاه از طریق تراریخت سازی استفاده می شود. کدوئین اُ- دمتیلاز (codm)، آنزیم انتهایی در مسیر بیوسنتزی مورفینان در گیاه شقایق می باشد که باعث دمتیلاسیون تبائین در موقعیت 3 و تبدیل آن به اوریپاوین و همچنین دمتیلاسیون کدوئین و تبدیل آن به مورفین می شود. در این پژوهش با هدف بررسی تأثیر خاموش سازی ژن codm بر پروفایل آلکالوئید های مهم انتهایی شبکه مورفینان، از تکنیک های rnai و vigs استفاده گردید. پس از شناسایی و جداسازی ژن codm با استفاده از آغازگرهای اختصاصی، بخش انتهایی cdna سنتز شده این ژن واقع در ناحیه 3? utr، به عنوان قطعه هدف خاموشی جهت سنس و آنتی سنس به ترتیب و طی دو مرحله در ناقل خاموشی pgsa1285 همسانه-سازی گردید. همچنین قطعه ژنی مذکور بار دیگر به منظور مطالعه خاموشی گذرای ژن codm، در ناقل ویروسی trv2 همسانه سازی شد و سپس با استفاده از آگروباکتری حاوی سازه، به برگهای نمونه های گیاهی مورد نظر تراریزش صورت گرفت. از طریق pcr ژن پروتئین پوششی ویروس trv، گیاهان تراریخت شده انتخاب شدند و سپس آنالیز نیمه کمی بیان ژن انجام شد. آنالیز نهایی خاموشی ژن ناشی از مکانیسم vigs نیز که با استفاده از pcrدر زمان واقعی انجام شد، کاهش 88 درصدی بیان ژن codm در مقایسه با نمونه های شاهد را نشان داد. جهت بهینه سازی و تعیین روش مناسب باززایی گیاهان تراریخت، آزمایش فاکتوریل با ? تکرار (هر پتری دیش حاوی 10 ریز نمونه معادل با یک تکرار) در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی با فاکتور های ریز نمونه (در دو سطح هیپوکوتیل و ریشه)، محیط کشت پایه (شامل دو سطحb5 و ms) و آنتی بیوتیک پارامومایسین (در سطوح غلظتی 10، 15 و 25 میلی گرم در لیتر)، طراحی و اجرا گردید. در مورد کالوس زایی نتایج نشان داد که میزان کالوس زایی در محیط ms به مراتب بهتر از محیط b5 بوده و بهترین نتیجه در ترکیب تیماری ریزنمونه هیپوکتیل در محیط ms با سطح آنتی بیوتیک mg/l 10 مشاهده گردید. دیده شد که ریزنمونه هیپوکوتیل در هر سه سطح آنتی بیوتیک و در دو محیط ms و b5 درصد کالوس زایی بیشتری در مقایسه با ریزنمونه ریشه دارا بود. همچنین میزان جنین زایی ریزنمونه ریشه در هر سه سطح آنتی بیوتیک و در هر دو محیط در مقایسه با ریزنمونه هیپوکوتیل، بیشتر بود.